普通小麦和中国节节麦LMW-GS,α-,γ-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

【摘要】面筋蛋白不仅是决定小麦加工品质的物质基础，而且是诱发乳糜泻（celiacdisease，CD）的主要外在刺激因子，筛选优质的面筋蛋白相关基因，对小麦加工品质的分子改良和CD预防具有重要的意义。HMW-GS组成已成为品质育种中亲本选配的主要依据，筛选优质的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因，是当前改良我国小麦加工品质的关键。普通小麦豫麦34、郑麦9023，郑麦004和郑丰5号，是我国黄淮麦区主要推广种植的优质小麦品种，中国节节麦，作为普通小麦D基因组的祖先供体种，具有其它谱系节节麦所缺乏的独特遗传变异，是小麦遗传改良的宝贵种质资源。因此，为筛选具有独特变异的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白优质基因和对小麦品质改良和CD预防有利用价值的宝贵节节麦种质资源，本研究在中国节节麦ISSR遗传多样性分析的基础上，采用PCR法，对4个优质小麦品种和2-7份代表性节节麦的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因进行系统的分子克隆，并利用GenBank中已注册的大量基因资源，通过氨基酸序列和二级结构的系统比较分析，不同分子结构基因的原核表达、纯化和qRT-PCR分析，揭示优质小麦优质的分子基础、CD毒性和LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因结构与功能的关系。为我国小麦加工品质的分子改良，以及中国节节麦在小麦品质改良和CD预防中的有效利用，奠定重要的研究基础和参考资料。主要取得如下结果：（1）从4个小麦品种和2-7份代表性中国节节麦中，共克隆注册了638（GenBank登录号为：JN831382-JN831435，JN849083-JN849096，JX828193-JX828401，KC715868-KC716082，KF278601-KF278638，KF412579-KF412621和KF880532-KF880594）个LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白新基因，筛选到76个在重复区长度和半胱氨酸残基数量存在独特变异的基因资源和2份含有较少T细胞免疫肽的节节麦种质资源。（2）推断氨基酸序列的比对分析表明，在C-末端I区和C-末端特征区II存在额外半胱氨酸残基的LMW-GS，α-醇溶蛋白基因，绝大多数来源D基因组，而在N-末端重复II区存在1个额外半胱氨酸残基的γ-醇溶蛋白基因，绝大多数来源于B基因组，且均在系统进化树上形成1个相对集中的分支。尽管LMW-GS中存在较少含有额外半胱氨酸残基的基因，但体外功能鉴定已证明D基因组来源的1个含额外半胱氨酸残基的基因，对面筋品质有显著影响。可见，与Glu-D1位点编码的HMW-GS对品质有独特贡献一样，Glu-D3，Gli-D2和Gli-B1位点编码的LMW-GS和α-，γ-醇溶蛋白，也对面筋品质密切相关。（3）二级结构的系统预测和比对分析表明，LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白的二级结构单元的形成位置有一定的保守性，但不同蛋白形成α-螺旋和β-折叠的数目、以及同一位置形成二级结构单元的长度却并不相同。其中，α-醇溶蛋白的2个特征区，γ-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺IV区和C-末端非重复V区，LMW-GS的C-末端特征I区和C-末端特征III区，是α-，γ-醇溶蛋白和LMW-GS重要的分子功能区。而对代表不同等位变异和不同单倍型的LMW-GS基因的二级结构的比对分析表明，Glu-D3位点，尤其是D3-2和D3-4型LMW-GS，对小麦加工品质的贡献最大，而Glu-A3位点的贡献最小。（4）对豫麦34中不同分子结构的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白的原核表达和qRT-PCR分析表明，体外高水平的原核表达，仍存在一定难度。但不同分子结构基因同期的表达水平存在明显差异。含有1个额外半胱氨酸残基或形成较多二级结构单元的优质候选LMW-GS，α-醇溶蛋白基因，表达水平明显高于经典基因，可能是影响小麦面筋品质的主要低分子量面筋蛋白组分。（5）对5种分布于α-，γ-醇溶蛋白的主要T细胞免疫优势多肽的识别分析表明，4个优质小麦品种均含有较多的T细胞免疫肽，有足够的潜力导致CD的发生。但一粒小麦和节节麦野生种质资源中，不含或含有较少T细胞免疫肽的例外基因的发现，进一步说明筛选并培育CD患者耐受的普通小麦品种是可能的。（6）77份中国节节麦的ISSR遗传多样性和2-7份代表性节节麦的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因的克隆和序列分析表明，黄河流域的中国节节麦，具有更广泛的遗传变异，尤其是ISSR聚类图中位于GroupII和GroupIII的黄河流域节节麦，至少是本实验采用的T006和SC-1，具有独特的遗传变异。不仅α-醇溶蛋白基因中不含或仅含有少数的T细胞免疫肽，γ-醇溶蛋白大多数在N-末端重复区含有1个额外的半胱氨酸残基，而且LMW-GS多与优质的D3-2和D3-4位点基因有较高的同源性，是小麦品质改良和CD预防可利用的宝贵种质资源。
【作者】李玉阁；
【导师】李锁平；
【作者基本信息】河南大学，植物学，2014，博士
【关键词】普通小麦；中国节节麦；LMW-GS；α-；γ-醇溶蛋白；序列分析；

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